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| Chromatographie de couches minces en utilisant les spectromètres à barrettes de diodes | |
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Bernd Spangenberg, Karl-Friedrich Klein*
Fachhochschule Offenburg, Badstrasse 24, D-77652 Offenburg
Télé. : (+49) 781 205-231, Fax (+49) 781 205-111; email: Spangenberg@fh-offenburg.de
*Fachhochschule Giessen-Friedberg, Wilhelm-Leuschner-Str. 13, D-61169 Friedberg
Résumé
HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography – chromatographie de couches minces à haute performance) est une méthode de séparation bien connue et variée qui a beaucoup d’avantages envers des autres techniques de séparation. Cette méthode est rapide, de bon marché et des prétraitements lents ne sont pas nécessaires. Nous avons développés un scanneur à barrettes de diodes résistant afin de registrer la distribution d’échantillon sur une platine HPTLC. Ce scanneur permet des registrations simultanées du spectre dans un domaine de 198 nm à 612 nm avec une résolution spectrale mieux que 0.8 nm.
La résolution spatiale sur la platine est mieux que 160 µm. La durée pour le mesurage de 450 spectres d’un seul trajet de séparation ne s’élève qu’à plus que deux minutes. Le nouveau scanneur à barrettes de diodes (en vente) offre une enquête rapide sur la séparation TLC donc rend possible plusieurs applications chimiométriques. Le système donne plus informations que le scanneur TLC utilisé usuellement.
1. Introduction
La chromatographie de couches minces « traditionnelle » ainsi que la chromatographie de couches minces à haute performance (HPTLC) sont des méthodes de séparation utilisés en grande partie et variées qui ont beaucoup d’avantages envers des autres techniques de séparation. Ces méthodes sont faciles à manier, rapides et de bon marché car des prétraitements lents ne sont pas nécessaires. Ils donc sont appropriés pour des essais de sélection dans analeptiques écologiques. Une autre application serait la pharmacie, notamment les études d’analyse sur les composants végétaux. La HPTLC est particulièrement appropriée de servir comme méthode pour la surveillance d’impuretés des substances car les composants de séparation sont visibles « à première vue » : aucune substance trouvée sur la platine ne peut être ignorée [1]. Nous avons développés un scanneur à barrettes de diodes résistant afin de registrer la distribution d’échantillon sur une platine HPTLC. La HPTLC utilise habituellement la phase normale de la séparation. La seule utilisation de la phase inversée peut être regardée comme une fonction supplémentaire. En comparant les deux systèmes de séparation on peut mettre en évidence que le système à phase normale dispose d’une plus haute sélectivité comme presque toutes les phases mobiles sont utilisables.
Les substances suivantes peuvent être utilisées pour des phases mobiles dans la RP-HPLC: eau, méthanol ainsi que THF [2] le cas échéant. Comme les mesures sont effectuées en liquides, l’utilisation des substances d’une haute absorption intrinsèque dans un domaine de la longueur d’onde de 200nm n’est pas recommandable pour des phases mobiles.
Dû au niveau d’impuretés plus bas, le méthanol et autres phases mobiles sont très chers. La phase mobile utilisée est désactivée de la technique HPTLC avant la marche d’essai – des perturbations y sont insignifiantes. Mais celles-ci sont très faibles par rapport à la masse de la phase mobile qui est rejetée après chaque séparation. Néanmoins, la méthode HPLC est appliquée plus souvent que la méthode HPTLC. Bien que la qualité de la séparation soit minimalement mauvaise et un peu plus défavorable, le plus grand désavantage dans la passé a été l’absence des systèmes HPTLC plein-automatisés. Concernant TLC les trois pas sont séparés temporellement : dépôt de la substance essayée, séparation et détection. C’est pour ça que le taux d’automatisation est très faible. Mais d’autre part, la flexibilité de la HPTLC est plus haute par rapport à HPLC. Néanmoins, la détection spectrale n’a jamais été implémentée dans HPTLC. Ça ce n’est pas compréhensible du tout car le développement de la détection des longueurs d’onde séparées vers la détection utilisant les spectromètres à barrettes de diodes a eu lieu dans HPLC avant 10 ans. Aujourd’hui l’évolution de la méthode TLC devient vers la même direction afin d’améliorer la technique d’une manière signifiante.
2. Equipement de mesure
Parallèle au système de détection nous avons développés un scanneur HPTLC robuste mesurant directement dans un domaine de la longueur d’onde de 198nm à 612nm [3] sur une platine à couche mince. Il y a des plans concernant l’expansion jusqu’à 1050nm. Le grand avantage du système est qu’il n’a plus besoin des lentilles et miroirs grâce aux fibres optiques. Les efforts pour l’alignement peuvent donc être minimisés. Grâce à ce spectromètre la résolution spatiale sur la platine est inférieure que 160µm et la résolution spectrale est env. 0.8nm. Le temps de mesure pour un trajet HPTLC d’env. 45mm prend entre 1 à 3 minutes dépendant du rapport signal/bruit. 450 ou 900 spectres différents comprenant 512 points d’information peuvent être mesurés pendant un seul scan.
L’élément principal du scanneur est l’assemblage fibre optique ajustée et optimisée comprenant un jeu de 25 fibres optiques d’émission et de collection. Les fibres de l’array fibre sont des fibres UVM valorisées [4] sans dopage par hydrogène. Dues aux 25 fibres en rang, la platine HPTLC peut être illuminée par une lampe deutérium en UV profond d’un largueur d’env. 5mm. La lumière soit être absorbée soit être disséminée pendant la phase stationnaire de la platine HPTLC. La lumière pour la détection sera collectée par un deuxième array fibre parallèle comprenant le même nombre de fibres. Cet array est conduit vers le détecteur à barrettes de diodes. Fig. 1 montre la fin de la tête chercheuse fibre optique sur la platine HPTLC. Le déplacement de la platine HPTLC pour les mesurages est piloté par ordinateur à une distance fixe de 450µm au-dessous de la tête de mesure en utilisant une translation x-y.
Contrairement à la méthode HPLC, il est possible de mesurer simultanément l’absorption et le spectre fluorescence par le système de séparation HPTLC. Les données de mesure qui sont générées dans un seul passage peuvent être analysées séparément.
Fig.1: Tête chercheuse à fibre optique : chaque fibre se compose d’un jeu de 50 fibres éprouvées UV [4] comprenant un diamètre de noyau de 100 µm
3. Produits chimiques et conditions de mesure
Tous les produits chimiques ont été obtenus par Merck (Darmstadt - Allemagne). L’eau déminéralisée n’est utilisée que pour la dilution.
Les paramètres différents pour la séparation sont indiqués dans le tableau ci-dessous.
| Généralités |
| Matériau de la platine : | Si60 sans indicateur fluorescence (Merck) |
| Application : | 7 mm semblable aux traits (CAMAG Linomat II)
Distance de 1mm entre chaque ligne
8 lignes sur une côté |
| Phase mobile : | Isopropanol, Toluol, NH3 (25%) [6,3,1 (V,V,V)] |
| Mesurages : | 450 spectres séparés |
| Durée: | 225 s |
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| Caféine | Purine |
| Masse : | 50ng caféine | 1 µg caféine et
2.5 µg purine |
| Trajet : | 45mm | 95 mm |
| Valeurs de référence : | Caféine : 50 | Acide urique : 1
Cytosine : 27, Guanine : 38,
Caféine : 51, Adénine : 59,
Uracile : 68, Thymine : 82 |
Tableau 1 -Paramètres de séparation
4. Résultats
Fig. 2 montre la séparation de la caféine. 50ng de caféine avec une distance de séparation de 45mm ont été utilisés et mesurés dans 225s. L’absorption de la lumière spectrale a été déterminée dépendant de la distance de séparation. La forme symétrique des crêtes d’absorption prouve l’absence des impuretés.
Fig. 2 : Affichage en 3D du spectre d’absorption d’une séparation caféine à une distance de 45mm. Une séparation de purine, cytosine, guanine, adénine, uracile et thymine est possible en utilisant la même phase mobile. Il donc n’y a pas une séparation exacte entre uracile et thymine. Comme affiché dans la figure 3 – la structure d’uracile et de thymine est assez similaire. Adénine et guanine ont également des structures chimiques qui sont assimilable à caféine et acide urique.
Fig. 3 : Les structures chimiques de l’acide urique, cytosine, guanine, caféine, adénine, uracile et thymine
Comme le spectre de l’uracile et de la thymine diffèrent faiblement des longueurs d’onde de 235nm et 280nm, ils peuvent être séparés de façon chimiométrique en utilisant l’analyse des composants multiples. Les données mesurées qui sont attribuées à une de ces substances peuvent être bien définies en utilisant la corrélation croisée [5]. Concernant le calcul présent, on a utilisé le spectre d’uracile à une distance de séparation de 51.1.mm et le spectre de thymine à 56.3mm. Comme affiché dans la figure 4 au-dessus du densitogramme mesuré à une longueur d’onde de 268nm, deux courbes des signaux ont été déterminés. Les signaux séparés de façon chimiométrique de ces deux composants peuvent être utilisés pour la quantification.
Fig. 4 : Analyse à deux composants pour la séparation chimiométrique d’uracile et de thymine à 268nm
Une séparation complète de cinq purines parallèle à la séparation de caféine et d’acide urique est possible sans calculs supplémentaires grâce aux paramètres de mesure de la séparation de purine (voir tableau 1). Fig. 5 montre la représentation du contour de cette séparation à une distance au-dessus de 90 mm comprenant 450 spectres. Le densitogramme à une longueur d’onde de 269.4nm se trouve au-dessus de ce contour. Le spectre de caféine à une distance de séparation de 50.5mm est affiché à gauche.
Fig. 5 : Représentation des contours d’une séparation de l’acide urique (1), cytosine (27), guanine (38), caféine (51), adénine (59), uracile (68) et thymine (82); les valeurs de référence sont indiquées en parenthèses;
à gauche : spectre de caféine à 50.3mm; à droite : densitogramme à 269.4nm
5. Sommaire
La qualité des spectres mesurés est excellente. Les substances peuvent être facilement identifiées grâce à nos librairies spectrales. Il est aussi remarquable que les solvants de la phase mobile ne présentent pas des parasites, car ceux-ci sont complètement enlevés avant la marche du mesurage. La représentation des contours donne un aperçu bref et compréhensible de la qualité de chaque séparation utilisée afin de déterminer d’une manière simple les longueurs d’onde pour une quantification plus détaillée. Ces spectres sont disponibles en outre pour des analyses de pureté de crêtes. Le système ne peut pas être distingué des autres détecteurs à barrettes de diodes en vente qui sont utilisés habituellement dans HPLC. Comparé avec les scanneurs à une seule longueur d’onde d’aujourd’hui utilisés dans TLC, beaucoup plus d’informations peuvent être reçus par un seul trajet HPTLC.
6. Littérature
[1] L. Kraus, A. Koch, S. Hoffstetter-Kuhn: “Dünnschichtchromatographie”. Springer-Verlag 1995
[2] V.R. Meyer: “Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie”. Verlag Salle+Sauerländer (1992),
112-118, 130
[3] B. Spangenberg, K.-F. Klein: “ „Fibre optical scanning with high resolution in thin layer chromatography“. J.Chromatogr. A, 898 (2000), pp. 265-269
[4] M. Huebner, H. Meyer, K.-F. Klein, G. Hillrichs, M. Ruetting, M. Veidemanis, B. Spangenberg, J. Clarkin,
G. Nelson: „Fiber-optic systems in the UV-region“.
SPIE-Proc. BiOS‘00, Vol. 3911, pp. 303-312 (San Jose, Jan. 2000)
[5] B.Spangenberg, B.Ahrens, K.-F.Klein:“TLC-analysis in forensic sciences using a diode-array detector”. Chromatographia Supplement, Vol. 53, p.438-441 (2001) |
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Dernier changement 08/13/2007 02:59 PM
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